Популар Постс

Избор Уредника - 2019

ПЦР (ланчана реакција полимеразе)

Не тако давно, развијен је поуздан, веома осетљив и брз метод за дијагностиковање разних заразних болести људи. Овај метод се зове "ПЦР анализа". Шта је то, каква је суштина, шта микроорганизми могу да открију и како да то постигну, рећи ћемо у нашем чланку.

Историја открића

Амерички научник Цареи Муллис 1983. године изумио је методу ланчане реакције полимеразе (ПЦР), а метода дијагностике корпорације Цетус, у којој је њен творац радио, изворно је патентирана. Али 1992. године сва права и патенти су продати Хоффман-Ла Роцхе. Након тога, испоставило се да су паралелне сличне студије спроведене и да су их забележили други амерички биолози, као што су Алице Цхан, Давид Едгар и Јохн Трелл. Године 1980, совјетски научници А. Слиусаренко, А. Каледин и С. Городетски такође су се бавили овим проблемом. Према томе, није било могуће утврдити носиоца појединачних права. Многи еминентни биохемичари допринели су развоју ПЦР методологије и патентирали су своје иновације. У овом тренутку, ПЦР анализа се обавља свуда у посебно опремљеним лабораторијама.

Зашто ПЦР дијагностика има такву вредност?


Једна од значајних предности ПЦР методе је висока осетљивост - од 95 до 100%. Међутим, ове бенефиције треба да се заснивају на неопходном поштовању следећих услова:

  1. исправно сакупљање, транспорт биолошког материјала,
  2. доступност стерилних, једнократних инструмената, специјалних лабораторија и обученог особља,
  3. строго придржавање метода и стерилности током анализе
Осетљивост је различита за различите детектабилне микробе. На пример, осетљивост ПЦР методе за откривање вируса хепатитиса Ц је 97-98%, а осетљивост за детекцију уреаплазме је 99-100%.

Могућности инхерентне ПЦР анализи, омогућавају нам да постигнемо ненадмашну аналитичку специфичност. То значи идентификацију микроорганизма који сте тражили, а који није сличан или уско повезан.
Дијагностичка осетљивост и специфичност ПЦР методе често су бољи од оних за културну методу, названу „златни стандард“ за откривање заразних болести. С обзиром на дужину култивације културе (од неколико дана до неколико седмица), предност ПЦР методе постаје очигледна.

ПЦР у дијагностици инфекција
Предности ПЦР методе (осјетљивост и специфичност) одређују широк спектар примјена у модерној медицини.
Главне примене ПЦР дијагностике:

  1. дијагностика акутних и хроничних инфективних болести различитих локализација
  2. праћење ефикасности терапије
  3. спецификација врсте патогена
ПЦР се користи у акушерству, гинекологији, неонатологији, педијатрији, урологији, венерологији, нефрологији, клиници инфективних болести, офталмологији, неурологији, фтиопсолмонологији итд.

Употреба ПЦР дијагностике проводи се заједно са другим методама истраживања (ЕЛИСА, ПИФ, РЕЕФ, итд.). Њихову комбинацију и сврсисходност одређује лекар.

Инфективни патогени откривени ПЦР-ом

Вируси:

  1. ретровируса ХИВ-1 и ХИВ-2
  2. херпетиформ вируси
  3. херпес симплек вирус тип 1 и 2
  4. цитомегаловирус
  5. Епстеин-Барр вирус
  6. варицелла - зостер вирус
  7. херпес хуманих вируса 6 и 7
  8. хепатитис Ц, Б и А
  9. хумани папилома вирус
  10. рубелла вирус
  11. аденовирусима
  12. риновируси
  13. парвовирусес
  14. пицорновирусес

Бактерије:
  1. мицобацтериум
  2. цхламидиа
  3. мицопласма
  4. салмонелла
  5. легионелла
  6. Цлостридиумс
  7. пале трепонема
  8. различите патогене врсте Е. цоли
  9. Вибрио цхолерае
  10. рицкеттсиа
  11. Стапхилоцоццус ауреус
  12. бактеријски узрочник менингитиса
  13. Хелицобацтер пилори
  14. уреапласма
  15. узрочник гонореје
  16. штап за дифтерију
  17. хемофилни бацил

Ова листа садржи најчешће инфективне агенсе откривене ПЦР-ом. У ствари, ова листа је много шира, стално се ажурира, пошто се синтетишу нова „семена“. Такође треба напоменути да је списак идентификованих патогена одређен присуством “прајмера” за идентификацију у арсеналу сваке специфичне лабораторије.

У чему је суштина ланчане реакције полимеразе?

ПЦР истраживање је постигнуће и велико достигнуће молекуларне биологије. То је метода која, откривањем микросита ДНК или РНК страног генетског материјала (генома), може препознати појединачне карактеристике својствене само једној врсти микроорганизма, а да је не збуњује са другим. Како функционише ПЦР метода и како успијева вратити слику понашања заразне ћелије у живом организму?

ПЦР процес

Тако је пронађен фрагмент нуклеинске киселине, али он је сам и није довољан да спроведе реакцију, стога је кодиран (копирање). Међутим, за даљи процес је потребан велики број таквих микропоцица, које могу да осигурају његову репродукцију комплетирањем нових ДНК сегмента идентичних пронађеном фрагменту (репликација). Репродукција је природна и инхерентна особина нуклеинске киселине која ће се поновити употребом ензим полимеразе чак и изван живог организма (у епрувети са узорком), формирајући многе клонове, то јест, ићи ће ланчана реакција. Клонират ће се сви нови и нови фрагменти, али само они у којима је истраживач заинтересиран. Зато је тако Важно је узети “чисту” анализу, без икаквих нечистоћа, и провести тест врло пажљиво.

Имајући у виду наведене способности ланчане реакције полимеразе, можете погодити зашто она тако лако разликује уреаплазму од микоплазме, или сваку од њих од хламидије.

Дакле, чак и ако се међу милионима ћелија људског тела, а не самим вирусом, изгуби, али само део његовог ДНК, онда ПЦР, ако га ништа не спречава, вероватно ће се носити са задатком и пријавити присуство „ванземаљаца“ са позитивним резултатом. То је суштина ПЦР-а и његове главне предности.

Снаге и слабости

Лабораторија која обавља ПЦР дијагностику има највише захтеве у погледу опреме, система тестирања и квалификација медицинског особља. То је високотехнолошки лабораториј са арсеналом високо осетљивих и високо специфичних реагенса, тако да нема никаквих специфичних недостатака. Да ли то даје позитиван резултат у одсуству клиничких манифестација, и тако поставља клинику пре дилеме: треба ли почети са лечењем или не?

Лекар, посматрајући пацијента, почиње да сумња у поузданост резултата испитивања, јер не види никакве знакове болести. Али ипак С обзиром на високу осетљивост ПЦР система, треба имати на уму да детектује патоген чак иу предклиничкој фази, а позитиван резултат у овом случају више је него предност. На основу тога, лекар мора одлучити о прикладности терапије, узимајући у обзир друге предности и недостатке.

Предности дијагностике полимеразном ланчаном реакцијом су очигледне:

  • Висока специфичностдостижући 100%, због присуства у узорку честица нуклеинских киселина које су својствене одређеном организму, али страном човеку,
  • Високе перформансезато што је ПЦР хигх-тецх аутоматизована техника која обезбеђује способност да се спроведе тестирање на дан узимања материјала и ослобађање пацијента од непотребних поремећаја,
  • ПЦР, који ради на једном узорку, је у стању да спроведе неколико студија и окодетектовати неколико патогена, ако ће она бити такав задатак. На пример, у дијагнози хламидијске инфекције, где је ПЦР једна од главних метода, заједно са хламидијом, могуће је детектовати неиссериа (гонокок), узрочника гонореје. Штавише, поузданост резултата није негативно погођена,
  • ПЦР тестирањепоказује опасне микроорганизме у периоду инкубацијекада нису имали времена да наносе значајна оштећења организму, тј. рана дијагноза упозорава на предстојећи развој патолошког процеса, који омогућава да се за њега припреми и узме га у потпуности наоружано.

Поред тога, да би се избегли неспоразуми, који се понекад јављају током дијагнозе, ПЦР се штити тиме што се његови резултати могу фиксирати (фото, компјутер) ради њихове употребе у стручне сврхе, ако је потребно.

Негативни одговор се сматра нормалним у ПЦР одговорима.што указује на одсуство фрагмената страних нуклеинских киселина, позитиван одговор ће указати на присуство инфекције у телу, дигиталне вредности указују на стање вируса и његову концентрацију у време тестирања. Међутим, потпуно дешифровање анализе врши лекар који је прошао посебну студију на тему ПЦР. Покушај да сами интерпретирате резултате нема никаквог смисла, јер је могуће, као што је вероватно да се деси, погрешно разумети и почети да бринете унапред.

Шта се ПЦР „боји“, шта је у стању да уради и како се припремити за то?

Као иу свим другим студијама, понекад се испостави да су резултати теста лажно позитивни или лажно негативнигде ПЦР није изузетак. То се може догодити у сљедећим случајевима:

  1. Кршења процеса у једној фази реакције,
  2. Непоштовање правила за узимање материјала, његово складиштење или транспорт,
  3. Присуство нечистоћа у материјалу.

Ово сугерише да се ПЦР дијагнози инфекција мора приступити пажљиво, пажљиво и пажљиво, иначе узорци материјала могу да промене структурну структуру или чак колапс.

Фазе ПЦР дијагностике. Лажни резултати могу изазвати неправилности у било којој фази истраживања.

ПЦР дијагностика инфекција спада у категорију "златних стандарда" међу осталим лабораторијским методама, тако да се може користити за тражење узрочника многих болести које на први поглед немају ништа заједничко:

  • Туберкулоза различите локализације, упале плућа (укључујући атипичне, узроковане кламидијом),
  • Инфекције детињства (рубеоле оспице, паротитис, оспице),
  • Дифтерија,
  • Салмонеллосис,
  • Зоонотска инфективна болест - листериоза (болест карактерише низ симптома са оштећењем лимфних чворова, централног нервног система, унутрашњих органа),
  • Болести изазване пенетрацијом Епстеин-Барр вируса (инфективна мононуклеоза, итд.),
  • Патологија рака изазвана ХПВ инфекцијом (ХПВ и њени типови),
  • Боррелиоза (лајмска болест, крпељни енцефалитис),
  • Хелицобацтер пилори инфекција, која је узрокована хуманим микробима Хелицобацтер пилори који живе у људском стомаку. Доказано је да Хелицобацтер изазива рак желуца или дуоденума 12,
  • Кандидијаза и практично све сполно преносиве болести.

ПЦР дијагностика полно преносивих инфекција је од посебног значаја, јер тако изазване болести често трају дуго без икаквих клиничких манифестација, али онда постају активније током трудноће и тиме угрожавају здравље, па чак и живот детета. ТОРЦХ инфекције се такође понашају слично. Неке од њих ("држање") примјењују се истовремено на СТИ, па стога потоње захтијева детаљније разматрање. Читатељ ће се моћи упознати с најпопуларнијим техникама у сљедећим дијеловима чланка.

Како се правилно припремити да бисте добили поуздан резултат?

Одмах ћемо приметити да је припрема за ПЦР прилично једноставна, не захтевајући посебан напор од стране пацијента. Потребно је само да испуните три једноставна задатка:

  1. Немојте имати сексуалне односе 24 сата пре теста,
  2. За прикупљање и анализу крви из вене, морате доћи на празан желудац, иначе, такође је немогуће пити,
  3. Рука за урин треба ноћ (ујутро - у стерилној посуди, купљена дан раније у апотеци).

ПЦР може радити у било ком биолошком окружењу

ПЦР метода није „крвожедна“, стога прихвата било који биолошки медиј који садржи сумњиви инфективни агенс. избор - оно што требате узети за истраживање, остаје за доктора.

Тако, у потрази за патогеном, поред теста крви (иако се такође уклапа и у већини случајева се узима паралелно са другим материјалом), можете користити:

  • Размаз (избацивање урогениталног тракта),
  • Гребање слузокоже уста, коњунктиве, назофаринкса, гениталног тракта (жене узимају из грлића материце и вагине, мушкарци из уретре),
  • Салива
  • Цум
  • Сок простате,
  • Плацентно ткиво и амнионска течност (амнионска течност),
  • Седимент урина (након центрифугирања), на пример, за откривање неких СПИ и Мицобацтериум туберцулосис,
  • Спутум и плеурална течност за исту сврху
  • Ексудати
  • Цереброспинална течност у случајевима сумње на инфективну лезију централног нервног система,
  • Биопсијски материјал (биопсија), узет из јетре, дуоденума, желуца, итд.

Желео бих да додам горе наведеном да ће материјал за тестирање у свим случајевима, чак иу шкрињама и екскрецијама бити довољан, пошто тестирање ПЦР методе не захтева велике запремине, има довољно анализа и неколико микролитара, који се обично узимају у Еппендорф-ову врсту микротубе и шаљу на истраживања.

ХИВ и полимераза ланчана реакција

Обично, приликом анонимне анкете у случају позитивних резултата имуноблотинга, дијагноза ХИВ инфекције се понавља. Ако се дијагноза потврди, пацијенту се прописују додатне студије:

  1. Користећи имунолошке реакције одредити апсолутне вриједности броја лимфоцита ЦД4 (имунокомпетентне ћелије - Т-помагачи или помагачи), које инфекција погађа на првом месту, након чега губе своје основне особине и не могу разликовати "своје" и нечије друго ". РНК вируса који циркулише у крвној плазми узима се као нормалне ћелије организма и не реагује на њих,
  2. Детекција вируса РНА ПЦР-ом и израчунавање концентрације вирусних честица у циљу утврђивања фазе, тежине патолошког процеса и прогнозе засноване на овим подацима. Наравно, ријеч "норма" у том смислу не постоји, јер је реакција увијек позитивна, а декодирање дигиталних вриједности је у надлежности лијечника.

ПЦР и хепатитис

Патогени хепатитис Ц могу се открити ПЦР-ом, најчешће се тест користи за дијагностику Ц хепатитиса, који се слабо детектује другим методама.

Вирус хепатитиса Ц (који садржи РНК) у свом понашању у људском телу подсећа на ХИВ. Закачивши у геном ћелије јетре (хепатоците), он остаје тамо чекајући свој сат, који може доћи након 2 године, најмање 20 година, па су га доктори назвали "благим убицом". Хепатитис Ц доводи до формирања малигног процеса у паренхиму јетре, који се манифестује у каснијим фазама. Имунолошки систем не примећује све ове догађаје, узимајући вирус за хепатоците. Истина, у неким количинама се производе антитела на вирус, али они не обезбеђују пристојан имуни одговор. За дијагнозу ЕЛИСА за хепатитис Ц није јако информативан, јер указује на то да је вирус оставио трагове, и да ли је и сам оставио непознат. Код ХЦВ-а познати су случајеви самоизљечења, док антитијела против вируса остају и настављају да циркулишу до краја живота (имунолошка меморија). ПЦР значајно испред формирања антитела и може детектовати вирусну честицу после 1-1,5 недеља, док се антитела могу појавити у опсегу од 2 месеца до шест месеци

ПЦР дијагностика у случају сумње на преједање вируса хепатитиса Ц у људском организму је најоптималнија метода истраживања, јер само она може препознати присуство “нежног непријатеља” у биопсији крви или јетре пацијента.

Међутим, понекад постоје случајеви када је АТ позитиван, а резултат ПЦР је негативан. Ово се понекад дешава са веома малом количином вируса или када је "успавана" у јетри без уласка у крвоток. Да би се пронашла истина, пацијент се поново анализира, или чак више од једног.

Инфекција хуманим папилома вирусом

ХПВ (хумани папилома вирус), ако се само-исцељење не догоди, може се, без манифестовања, дуго задржати у телу домаћина, што се чак и не сумња, јер ПЦР није учињен, а симптоми су били одсутни. Међутим, присутност инфекције хуманим папилома вирусом, иако латентна, далеко је од индиферентног према људском здрављу, гдје су одређени типови вируса који узрокују рак посебно опасни (типови 16, 18).

Чешће, женска половина популације пати од ХПВ-а, јер вирус воли више женске гениталије, а посебно грлића материце, гдје неки типови вируса доприносе развоју диспластичних процеса, а затим рака грлића материце, ако не лијечите дисплазију и ослобађате вирус. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения трихомонады или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

ТОРЦХ инфекције и СПИ су толико међусобно повезане да је понекад тешко одредити којој групи ће се одредити одређени патоген. Они су генерално тешко разумљиви, јер су то прилично различите групе микроорганизама које се увијек могу преносити сполно или само под одређеним увјетима (имунодефицијенција), а могу бити од интереса само за вријеме трудноће, због могућег негативног утјецаја на њен ток и на фетус.

ПЦР - главни метод за откривање скривених инфекција

Развој клиничких манифестација заснива се на различитим патогенима, који се могу наћи само ПЦР-ом, који је његов главни задатак, понекад заједно са ЕЛИСА-ом, а понекад и са ЕЛИСА-ом. као једини потврдни тест, посебно ако симптоми болести нису присутни. Таква тешка ситуација може створити полимикробну инфекцију, која, поред отворених узрочника, укључује и опортунистичке патогене.

Код мушкараца који пате од инфламаторних обољења гениталне сфере, често се откривају уретритис, кламидија, уреаплазма и микоплазма. Ти исти типови су опасни и женско тело. Они који познају перфидност хламидије и који су наишли на то сигурно ће запамтити како је тешко пронаћи и препознати је, стога је анализа ПЦР-а о кламидији посебно поуздана, јер се паразит који се скрива у ћелији врло малих димензија понаша опрезно и увијек штети потајно.

Уреаплазма се често сматра паралелном са микоплазмом. И то није случајно. Ове врсте, као што је хламидија, нису нити вируси нити бактерије, живе унутар ћелија и припадају СПИ, иако је њихово присуство у здравом организму далеко од неуобичајеног. Дакле, да би се разликовао здрав носач од болесне особе, потребне су посебне методе у којима се ПЦР сматра најпоузданијем, јер су, због природе структуре и понашања ових микроорганизама, друге студије неефикасне.

Што се тиче херпес вируса (тип 1, 2) и цитомегаловируса, који такође припада херпес вирусима (тип 5), ситуација је такође двосмислена. Инфекција светске популације се приближава 100%, тако да је у овом случају веома важна идентификација вируса и његове дозе, што посебно има улогу у трудноћи, јер одрасла особа која је укорењена у његовом телу често не изазива никакве проблеме и не даје знакове болести.

Стога, сличан преглед који је прописао лекар не би требало занемарити, јер је у неким случајевима ланчана реакција полимеразе неопходна и неопходна метода лабораторијске дијагностике која може заштитити не само жену, већ и малу, нерођену особу од озбиљних компликација.

У закључку, желио бих напоменути да је тако дивна метода, као што је ПЦР, служила човјечанству више од 30 година. Истовремено, задаци теста нису ограничени на потрагу за патогенима заразних болести. Ланчана реакција полимеразе, рођена на бази молекуларне биологије, нераскидиво је повезана са генетиком успешно се користи у форензици за личну идентификацију, у судској медицини за утврђивање очинства, у ветеринарској медицини, ако клиника за животиње има прилику да набави скупу опрему, као иу другим областима (индустрија, пољопривреда, итд.).

Суштина методе ПЦР дијагностике

ПЦР анализа: шта је то и како ради? Суштина методе је у употреби посебног ензима ДНК полимеразе ин витро за повећање волумена одређене микробне средине. Да бисте то урадили, помножите расположиви ДНК материјал. Тако, у присуству патогеног микроорганизма у узорку, његова количина ће се повећати услед биохемијских лабораторијских манипулација, а бактерија неће бити тешко детектовати у микроскопу.

Како је истраживачки материјал?

За потребну анализу:

  • ДНА матрик
  • прајмери ​​који повезују крајеве комада материјала
  • ензим отпоран на топлоту ДНА полимеразе,
  • хемикалије које ензиме чине исправним,
  • пуферски раствор неопходан за стварање одговарајућих услова за раст и развој ДНК материјала.

За извођење ПЦР-а изведите 25-30 понављања, која се састоје од три фазе: денатурације, жарења и елонгације.

За анализу полимерне ланчане реакције користећи посебан уређај - појачало. Савремена опрема омогућава инсталацију потребног програма грејања и хлађења цеви ради елиминисања грешака током дијагностике.

Где се примењује дијагноза?

Метода ланчане реакције полимеза се користи у различитим областима медицине:

  • криминолози га користе за идентификацију генетског материјала, као што су коса, пљувачка или крв,
  • ПЦР тест крви помаже код генотипизације, на пример, за детекцију индивидуалне генетски инкорпориране реакције на одређени лек,
  • Користећи овај метод, утврдите постојање сродства међу људима
  • Најпопуларнија метода ПЦР-а постала је у медицинској дијагностици за одређивање различитих заразних болести.

Које инфекције открива ПЦР?

Дакле, медицина је дуго и успјешно користила анализу ПЦР-а. Шта је то, већ смо научили. И који патогени могу бити откривени са њом? Следеће инфективне болести се дијагностикују помоћу ПЦР:

  • Хепатитис А, Б, Ц,
  • уреапласмоза,
  • кандидијаза
  • цхламидиа
  • мицопласмосис
  • Гарднереллосис
  • инфективна мононуклеоза,
  • трицхомониасис
  • инфекција хуманим папилома вирусом
  • туберкулоза,
  • херпесна инфекција првог и другог типа,
  • хеликобактериоза,
  • цитомегаловирус,
  • дифтерија,
  • салмонела,
  • ХИВ инфекција.

Такође, ПЦР методе се користе у дијагностици рака.

Предности методе

Дијагноза ПЦР има неколико предности:

  1. Висока осетљивост. Чак и са само неколико молекула ДНК микроорганизма, ПЦР анализа одређује присуство инфекције. Помоћи ће методу за хроничне и латентне болести. Често, у таквим случајевима, микроорганизам се необрађује на други начин.
  2. Било који материјал је погодан за истраживање, на пример, пљувачка, крв, генитални секрет, коса, епителне ћелије. Најчешћи је тест крви и урогенитални размаз на ПЦР.

Препоруке за припрему за анализу

Да би резултати били поуздани приликом провођења ПЦР студије, потребно је проћи анализу, слиједећи препоруке о прелиминарној припреми за дијагнозу:

  1. Пре испоруке слине треба да се уздржите од једења хране и лекова 4 сата пре прикупљања материјала. Непосредно пре процедуре испрати уста прокуханом водом.
  2. Горе наведена правила треба слиједити када се узорак узима из унутрашњости образа. Након испирања препоручује се да се лагано масира кожу како би се истакла тајна жлезде.
  3. Урин се обично скупља код куће. За то је потребно да држите пажљиво тоалет гениталија. У стерилној пластичној посуди треба сакупити 50-60 мл урина. Да би се обезбедила чистоћа материјала, препоручује се женама да убаце тампон у вагину, а мушкарцима да повуку кожни прегиб што је више могуће. Материјал не можете проћи током менструалног периода.
  4. Да бисте донирали сперму морате се суздржати од секса 3 дана пре узимања материјала. Такође, лекари саветују да не идете у сауну и да се купате, пијете алкохол и зачините храну. 3 сата пре анализе треба да се уздржите од уринирања.
  5. За испоруку урогениталног размаза, на пример, ако се анализира ПЦР хламидија, и женама и мушкарцима се препоручује да имају сексуални одмор 3 дана. 2 недеље пре анализе не могу узети антибактеријске лекове. За недељу дана треба да престанете да користите интимне гелове, масти, вагиналне супозиторије, испирање. 3 сата пре теста, требало би да се уздржите од уринирања. Током менструације, материјал се не сакупља, само 3 дана након престанка крвног исцједка може се узети урогенитални размаз.

ПЦР током трудноће

Док чекају бебу, многе сексуално преносиве инфекције су изузетно опасне за нормалан развој фетуса. СТД могу изазвати интраутерино заостајање у расту, побачај или прерано рођење и урођене малформације детета. Због тога је изузетно важно проћи ПЦР преглед у раној трудноћи. Проћи анализу је потребно за регистрацију - до 12 седмица.

Материјал се узима из цервикалног канала специјалном четком. Поступак је безболан и не представља опасност за бебу. Обично се током трудноће хламидија анализира ПЦР методом, као и уреаплазмозом, микоплазмозом, цитомегаловирусом, херпесом, папилома вирусом. Такво сложено истраживање названо ПЦР-6.

ПЦР за дијагнозу ХИВ-а

Због чињенице да је ланчана реакција полимеразе веома осетљива на промене у телу и на услове дијагнозе, многи фактори могу утицати на резултат. Стога, ПЦР анализа за ХИВ инфекцију није поуздана метода, њена ефикасност је 96–98%. У преосталих 2-4% случајева, тест даје лажне позитивне резултате.

Али у неким ситуацијама немогуће је без ПЦР дијагностике ХИВ-а. Обично се врши код особа са лажним негативним резултатом ЕЛИСА. Такви индикатори указују на то да особа још није развила антитела на вирус и да их је немогуће детектовати без вишеструког повећања броја. То је оно што се може постићи тестом крви помоћу ПЦР методе.

Таква дијагноза је такође неопходна за децу прве године живота рођене од ХИВ позитивне мајке. Метода је једини начин да се поуздано одреди статус детета.

ПЦР за дијагнозу хепатитиса

Метода ланчане реакције полимеразе омогућава детекцију ДНК вируса хепатитиса А, Б, Ц дуго пре формирања антитела на инфекцију или појаве симптома болести. ПЦР анализа за хепатитис Ц је посебно ефикасна, јер је у 85% случајева таква болест асимптоматска и иде у хроничну фазу без правовременог лијечења.

Рано откривање патогена помоћи ће да се избјегну компликације и дуготрајно лијечење.

Свеобухватни ПЦР преглед

Свеобухватна ПЦР анализа: шта је то? Ово је ланчана реакција полимеразе, која укључује идентификацију неколико типова инфекција у исто време: мицопласма гениталиум, мицопласма хоминис, гарднерелла вагиналис, цандида, трихомонас, цитомегаловирус, уреапласма уреалитикум, херпес симплекс првог и другог типа, гонореја, сифилис, папиломавирус, папиломавирус, папиломавитис, херпеситис 1. и 2. врсте, гономера, пимплазма. Цена такве дијагностике креће се од 2.000 до 3.500 рубаља. у зависности од клинике, коришћени материјали и опрема, као и врста анализе: квалитативни или квантитативни. Шта је потребно у вашем случају - доктор ће одлучити. У неким случајевима, довољно је само одредити присуство патогена, у другима, на пример, у случају ХИВ инфекције, важну улогу игра квантитативни титар. Приликом дијагностиковања свих горе наведених патогена, истраживање се зове "ПЦР-12 анализа".

Дешифровање резултата анализе

Декодирање ПЦР анализе је лако. Постоје само 2 скале индикатора - “позитиван резултат” и “негативан резултат”. Када се открије патоген, лекари могу са 99% сигурношћу потврдити присуство болести и наставити са лечењем пацијента. У квантитативној методи одређивања инфекције у одговарајућој колони биће приказан нумерички индикатор откривених бактерија. Само лекар може одредити обим болести и прописати потребан третман.

У неким случајевима, на примјер, код одређивања ХИВ инфекције ПЦР-ом, са негативним резултатом, потребно је провести додатне прегледе како би се потврдили добивени показатељи.

Где узети анализу?

Гдје проћи ПЦР анализу: у јавној клиници или у приватној лабораторији? Нажалост, у општинским здравственим установама опрема и методе често су застарјели. Стога је боље дати предност приватним лабораторијама са модерном опремом и висококвалификованим кадровима. Поред тога, у приватној клиници ћете добити много брже резултате.

У Москви, многе приватне лабораторије нуде ПЦР анализу за различите инфекције. На пример, у клиникама као што су Вита, Комплекс клинике, Срећна породица, Уро-Про, анализирају ПЦР. Цена истраживања је од 200 рубаља. за одређивање једног патогена.

Може се закључити да је дијагноза инфективних болести ПЦР-ом у већини случајева брз и поуздан начин за откривање патогена у организму у раним фазама инфекције. Али ипак, у неким случајевима вреди изабрати друге методе дијагностике. Само стручњак може одредити потребу за таквом студијом. Декодирање ПЦР анализе такођер захтијева професионални приступ. Пратите препоруке лекара и немојте сами да радите тестове који нису неопходни.

Предности ПЦР дијагностике у савременој медицини:

• Директно откривање присуства патогена (наиме, специфичног региона ДНК или РНК патогена) у узорку који се испитује.
• Висока специфичност вам омогућава да одредите јединствену ДНК или РНК област која је карактеристична за специфични патоген, што елиминише могућност лажне реакције.
• Висока осетљивост ПЦР методе омогућава детекцију чак и појединачних ћелија патогена (вируса, бактерија). Осетљивост ПЦР анализе је 10-1000 ћелија у испитиваном узорку (на пример, осетљивост имунолошких и микроскопских тестова је само 103-105 ћелија).
• Развој универзалног ПЦР метода за детекцију различитих патогена. Циљ истраживања помоћу ПЦР-а је генетски материјал (ДНК, РНК) патогена. Техника омогућава идентификацију неколико патогена из једног биолошког узорка.
• Довољно брзо да бисте добили резултате анализе. Потпуно истраживање се врши у 4-4,5 сати, рјеђе - мало дуже.
• Могућност откривања патогена прије појаве симптома (претклиничка дијагноза) и након посљедње болести (ретроспективна дијагноза). Примјер предклиничке дијагностике ће бити преглед у периоду инкубације (од тренутка инфекције до појаве притужби пацијента), као и латентне инфекције (када уопште нема симптома, већ само лабораторијски подаци - ПЦР, на примјер). Једна од важних тачака ПЦР дијагностике је ПЦР у архивском материјалу или биолошким остацима, што је важно за идентификацију особе или очинства.

Тренутно, ПЦР дијагностика пролази кроз значајан развој. Сама метода се побољшава, нове врсте ПЦР-а се појављују изнова и изнова, нови тестни системи за ову реакцију долазе на медицинско тржиште. Због тога, трошкови ПЦР студија сваке године постају приступачнији за широк спектар пацијената.

На чему се заснива ПЦР метода?

Основа ланчане реакције полимеразе је поновљено удвостручење (амплификација) одређене секције ДНК или РНК уз помоћ ензима у лабораторији. Резултат је количина ДНК или РНК довољна за визуелну анализу. У току студије, копира се само површина која се уклапа под одређеним условима, и то само у ситуацији њеног присуства у узорку који се испитује.

На пример, материјал за студију, који претпоставља присуство фрагмената ДНК или РНК патогена (слина, крв, урин, исцједак из гениталија), налази се у специјалном реактору (појачало). Затим се додају специфични ензими који се везују за ДНК или РНК патогена, а његова копија се синтетише. Ово копирање се одвија у неколико фаза типа "ланчане реакције", и на крају стотине и хиљаде копија може бити формирано из једне копије генетског материјала. Затим се врши анализа и поређење резултата са постојећом базом података о структури различитих патогена. Путем ПЦР-а могуће је не само идентифицирати врсту патогена, већ и произвести квантитативни резултат анализе, односно, колико се патогена налази у људском тијелу.

ПЦР метода тренутно проширује спектар истраживачких могућности: увођење мутација, спајање ДНК фрагмената, и широко се користи у медицини, на примјер, за успостављање очинства, појаву нових гена, и тако даље.

Које инфекције се могу открити уз помоћ ПЦР дијагнозе

1) ХИВ инфекција (може открити вирус хумане имунодефицијенције ХИВ-1)
2) вирусни хепатитис А, Б, Ц, Г (РНА-ХАВ, ДНА-ХБВ, РНА-ХЦВ, РНА-ХГВ)
3) Инфективна мононуклеоза (ДНА Епстеин-Барр-ВЕБ)
4) Цитомегаловирусна инфекција (ДНА-ЦМВ)
5) Херпес инфекција (херпес симплек ДНА - ХСВ тип 1 и 2)
6) СПИ (полно преносиве инфекције) - уреапласмоза, гарднереллосис, кламидија, микоплазмоза, трихомонијаза,
7) Туберкулоза (Мицобацтериум туберцулосис)
8) Онкогени вируси - инфекција хуманим папилома вирусом (хумани папилома вирус (укључујући онкогене врсте 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 и 59) т
9) Боррелиоза, крпељни енцефалитис
10) Листериоза
11) Цандида (гљиве рода Цандида)
12) Хелицобацтер пилори инфекција (Хелицобацтер пилори)
и други

С обзиром на спектар патогена, ПЦР дијагностика се активно користи у гинеколошкој, уролошкој пракси, пракси специјалиста за заразне болести, у пулмологији, фтиологији, гастроентерологији, хематологији, онкологији и др.

Материал для исследования и правила его забора

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

Испитивање сексуално преносивих инфекција (СПИ) код мушкараца и жена укључује секрет из гениталија, размаз или стругање из грлића материце, размаз или стругање из уретре (уретре), урина.

При испитивању инфекција (херпес инфекције, ЦМВИ, мононуклеоза, токсоплазмоза, хепатитис Б, Ц, ХИВ инфекција), крв се сакупља на ПЦР.

За дијагнозу инфективне мононуклеозе, ЦМВ, херпетичну инфекцију узима се брис грла, за тестирање на ЦМВ - урин. Често, за испитивање лезија нервног система, бројне студије прикупљају спиналну течност.

У пулмологији је материјал спутум, плеурална течност.

Код испитивања интраутериних инфекција - плодне течности, плацентног ткива.

Припрема за испоруку материјала и ПЦР дијагностику

Готово сви пацијенти који се подвргавају ПЦР дијагностици имају право да се поуздају у поуздане, тачне и брзе резултате, који у великој мери зависе од капацитета лабораторије и професионалности лабораторијског техничара. Истовремено, многи људи не мисле да та поузданост у многоме зависи од нас самих, односно од препорука лекара, начина живота и исправности узорковања материјала. Када се узима материјал, потребни су услови који искључују контаминацију (контаминацију) материјала и, сходно томе, доводе у питање објективност анализе.

Правилна припрема за испоруку материјала није посебно тешка. Постоје следеће препоруке лекара за пацијенте:

1) да нема сексуалног живота дан прије испоруке материјала,
2) крв за истраживање се предаје ујутро на празан желудац (не јести, не пити),
3) након испоруке урина, први јутарњи део се сакупља у чисту стерилну посуду.

Објашњење резултата ПЦР

Негативно ПЦР резултат указује да нису пронађени трагови инфективних агенаса у материјалу који се испитује у време испоруке. Већина случајева показује одсуство инфекције, коју су покушали да пронађу у тесту.

Позитивно ПЦР резултат указује на детекцију трагова инфекције у биолошком узорку који се испитује. Са великом тачношћу, позитиван резултат указује на присуство инфекције у датом тренутку.

Постоје ситуације када је ПЦР позитиван, а немогуће је говорити о активној инфекцији - то је такозвано "здраво стање носиоца" без клиничких симптома болести, које не захтијевају лијечење, али захтијева динамично проматрање од лијечника. Уочава се чешће у бројним вирусним инфекцијама (ХПВ, ЦМВИ, ЕБВ инфекција, херпес инфекција, итд.) У материјалима као што су пљувачка, стругање цервикалног канала, уретра, односно из локалног фокуса. Међутим, не смијемо заборавити да је пријенос од носилаца на здраве људе могућ, као и прелазак на хронични облик болести с процесом активације. Ако је ПЦР позитиван у крви, онда то више није стање носиоца и захтева специфичан третман.

Квантитативни резултат ПЦР се процењује само од стране лекара појединачно за инфекцију одвојено и нема заједничке градације. На основу квантитативног резултата ПЦР-а, лекар може одредити степен активности инфекције и одредити фазу болести, што ће свакако утицати на ток и дозе прописаних лекова.

Једно од последњих узбудљивих питања: колико је тачна ПЦР дијагностика?

За ПЦР анализу постоје 3 дефиниције:

1. Тачност (са великом вероватноћом могућег откривања или одсуства инфекције).
2. Специфичност (тачност детекције специфичне инфекције).
3. Осетљивост (чак и са ниским садржајем генетског материјала патогена у испитиваном узорку, инфекција ће бити детектована).

Полимеразно-ланчана реакција готово да не даје лажно позитивне резултате (то јест, нема позитивних узорака у којима нема инфекције). Лажно негативни резултати се ретко примећују (чешће је то повезано са одсуством активне инфекције код особе у овом тренутку). На пример, латентна инфекција, хронична инфекција ван активности.

Садржај

Почетком седамдесетих, норвешки научник Кјелл Клеппе из лабораторије добитника Нобелове награде Кхара Гобинда Куран предложио је метод за појачавање ДНК помоћу пара кратких једноланчаних ДНА молекула - синтетичких прајмера [1]. Међутим, у то време ова идеја је остала неиспуњена. Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) изумила је 1983. године амерички биохемичар Цареи Муллис [2] [3]. Његов циљ је био да створи метод који би омогућио амплификацију ДНК у току вишеструких узастопних удвостручења оригиналне ДНК молекуле помоћу ензимске ДНА полимеразе. Прва публикација о ПЦР методи појавила се у новембру 1985. године у часопису Сциенце [4]. Метод је револуционирао молекуларну биологију и медицину. Године 1993. Цареи Муллис је за ово добио Нобелову награду за хемију. [5].

На почетку примене методе, после сваког циклуса грејања и хлађења, ДНК полимераза је морала да се дода у реакциону смешу, пошто је била инактивирана на високој температури неопходној за одвајање ланаца ДНК хеликса. Поступак реакције био је релативно неефикасан, захтијевајући много времена и ензима. 1986. године, метод полимеразне ланчане реакције је значајно побољшан. Предложено је да се користе ДНК полимеразе из термофилних бактерија [6]. Ови ензими су били термостабилни и били су у стању да издрже многе циклусе реакције. Њихова употреба је омогућила поједностављење и аутоматизацију ПЦР-а. Једна од првих термостабилних ДНА полимераза је изолована из бактерија Тхермус акуатицус анд намед Так-полимераза. Недостатак ове полимеразе је прилично велика вероватноћа увођења погрешног нуклеотида, јер овај ензим нема механизме за корекцију грешака (3 '→ 5'-ексонуклеазна активност). Полимерасе Пфу и Пвоизоловани из археја, поседују овај механизам, њихова употреба значајно смањује број мутација у ДНК, али је њихова брзина (процесност) мања од брзине Так. Сада нанесите смешу Так и Пфуда истовремено постигне високу брзину очвршћавања и високу прецизност копирања.

У време проналаска методе, Цареи Муллис је радио као синтетички хемичар (синтетисао је олигонуклеотиде, који су затим коришћени да идентификују тачкасте мутације хибридизацијом са геномском ДНК) у Цетусу (Цетус Цорпоратион), који је патентирао ПЦР методу. Цетус је 1992. године продао права на методу и патент Так-полимераза компанија Хофман-Ла Роцхе за 300 милиона долара. Међутим, испоставило се да Так-полимеразу су карактерисали совјетски биохемичари А. Каледин, А. Слусаренко и С. Городетски 1980. године [7], а 4 године прије совјетске публикације, 1976. године амерички биокемичари Алице Цхиен, Давид Б. Едгар и Јохн М. Трела. [8] С тим у вези, компанија Промега је у судском налогу присилила Росха да се одрекне искључивих права на овај ензим [9]. Амерички патент за ПЦР истекао је у марту 2005. године.

Метода се заснива на поновљеном селективном копирању одређене секције ДНК нуклеинске киселине уз помоћ ензима у вештачким условима (ин витро). Када се то деси, копира се само подручје које задовољава специфициране услове, и само ако је присутно у узорку који се испитује. За разлику од амплификације ДНК у живим организмима (репликација), релативно кратке секције ДНК су појачане ПЦР-ом. У конвенционалном ПЦР процесу, дужина секција ДНК које треба копирати је не више од 3000 парова база (3 кбп [10]). Користећи мешавину различитих полимераза, уз употребу адитива и под одређеним условима, дужина ПЦР фрагмента може достићи 20-40 хиљада парова база. И даље је значајно мања од дужине хромозомске ДНК еукариотске ћелије. На пример, људски геном се састоји од око 3 милијарде парова база [11].

Компоненте реакције Уреди

У најједноставнијем случају, за ПЦР су потребне следеће компоненте:

  • ДНА матриккоја садржи ДНК коју треба појачати.
  • Два примеракомплементарне супротним крајевима различитих ланаца жељеног фрагмента ДНА.
  • Тхермостабле ДНА полимерасе Ензим који катализира реакцију полимеризације ДНК. Полимераза за употребу у ПЦР мора дуго да остане активна на високим температурама, тако да се користе ензими изоловани из термофила - Тхермус акуатицус (Так-полимераза), Пироцоццус фуриосус (Пфу-полимераза), Пироцоццус воесеи (Пво-полимераза), Тхермус тхермопхилус (Ттхполимеразе) и друге.
  • Деокирибонуцлеосиде трипхоспхатес (дАТП, дГТП, дЦТП, дТТП).
  • Мг 2+ иони потребни за рад полимеразе.
  • Буффер солутионобезбеђивање неопходних услова реакције - пХ, јонска снага раствора. Садржи со, албумин говеђег серума.

Да би се избегло испаравање реакционе смеше, у епрувету се додаје уље високог врелишта, на пример, вазелинско уље. Ако се користи поклопац за гријање, то није потребно.

Додавање пирофосфатазе може повећати принос ПЦР реакције. Овај ензим катализира хидролизу пирофосфата, нуспродукта додавања нуклеотидних трифосфата у растући ланац ДНК, у ортофосфат. Пирофосфат може инхибирати ПЦР реакцију [12].

Примерс Едит

Специфичност ПЦР се заснива на формирању комплементарних комплекса између матрице и прајмера, кратких синтетичких олигонуклеотида дужине од 18-30 база. Сваки од примера је комплементаран једном од ланаца дволанчане матрице и ограничава почетак и крај амплификоване регије.

После хибридизације матрице са прајмером (жарење [13]), последњи служи као прајмер за ДНК полимеразу током синтезе комплементарног ланца матрице (види доле).

Најважнија карактеристика прајмера је тачка топљења (Тма) комплексни прајмер-матрикс.

Тм - температура на којој половина ДНК обрасца формира комплекс са олигонуклеотидним прајмером. Усредњена формула бројања Тм за кратки олигонуклеотид (и за дуге фрагменте ДНК), узимајући у обзир концентрацију К + и јона ДМСО:

где је Л број нуклеотида у прајмеру, К + је моларна концентрација калијумових јона, Г + Ц је сума свих гванина и цитозина.

У случају погрешног избора дужине и нуклеотидне композиције прајмера или температуре жарења, могуће је формирање делимично комплементарних комплекса са другим регионима шаблона ДНК, што може довести до појаве неспецифичних производа. Горња граница тачке топљења је ограничена оптималном температуром полимеразе, чија активност пада на температурама изнад 80 ° Ц.

Приликом избора примера пожељно је придржавати се следећих критеријума:

40—60 %,

  • цлосе тм прајмери ​​(разлике не више од 5 ° Ц),
  • одсуство неспецифичних секундарних структура - укосница [15] и димера [16],
  • Пожељно је да гванин или цитозин буду присутни на 3'-крају, пошто они формирају три водоничне везе са молекулом матрикса, што чини хибридизацију стабилнијом.
  • Амплифиер Едит

    ПЦР се изводи у термални циклер - уређај који обезбеђује периодично хлађење и загревање цеви, обично са тачношћу од најмање 0.1 ° Ц. Модерна појачала омогућују вам постављање сложених програма, укључујући могућност "врућег старта", тоуцхдовн ПЦР-а (види доље) и накнадно похрањивање појачаних молекула на 4 ° Ц. За ПЦР у реалном времену производе се инструменти опремљени флуоресцентним детектором. Ту су и уређаји са аутоматским поклопцем и одељком за микроплоче, који им омогућава да буду уграђени у аутоматизоване системе.

    Обично се током ПЦР-а изводи 20-35 циклуса, од којих се сваки састоји од три фазе (слика 2).

    Денатуратион Едит

    Дводелни ДНК шаблон се загрева на 94–96 ° Ц (или до 98 ° Ц, ако се користи посебно стабилна термостабилна полимераза) 0,5–2 мин, тако да се ДНК ланци раздвоје. Ова фаза се назива топљење (денатурација)јер су уништене водикове везе између два ланца ДНК. Обично, пре првог циклуса, дуго загревање реакционе смеше се врши 2-5 минута да би се пуна денатурирала шаблона и прајмери.

    Аннеалинг Едит

    Када се ланци раздвоје, температура се спушта тако да се прајмери ​​могу везати за једноланчану матрицу. Ова фаза се зове аннеалинг. Температура жарења зависи од композиције прајмера и обично се бира 5 степени ниже од тачке топљења прајмера. Погрешан избор температуре жарења доводи или до слабог везивања прајмера за матрицу (на повишеној температури), или до везивања на погрешном месту и појаве неспецифичних производа (на ниској температури). Време фазе жарења је 30 секунди, а за то време полимераза већ има времена да синтетише неколико стотина нуклеотида. Због тога се препоручује да се одаберу прајмери ​​са тачком топљења изнад 60 ° Ц и да се истовремено изврше жарење и издужење, на 60-72 ° Ц.

    Елонгатион Едит

    ДНК полимераза репликује шаблону шаблона користећи почетник као семе. Ово је позорница издужење. Полимераза почиње синтезу другог ланца од 3'-краја прајмера који је повезан са матрицом, и креће се дуж матрице, синтетизујући нови ланац у правцу од 5'- до 3'-краја. Температура истезања зависи од полимеразе. Често коришћене полимеразе Так и Пфу најактивнији на 72 ° Ц. Време елонгације зависи и од типа ДНК полимеразе и од дужине амплификованог фрагмента. Обично је време издужења једнако једном минуту за сваких хиљаду парова база. Након завршетка свих циклуса, често се изводи додатна фаза. крајње издужењеда заврши све фрагменте са једним ланцем. Ова фаза траје 7-10 минута.

    Количина специфичног производа реакције (ограничена прајмерима) теоретски се повећава пропорционално са 2 н - 2н, где је н број реакционих циклуса [17]. У ствари, ефикасност сваког циклуса може бити мања од 100%, тако да у стварности П

    (1 + Е) н, где је П количина производа, Е је просечна ефикасност циклуса.

    Број "дугих" копија ДНК такође расте, али линеарно, тако да специфични фрагмент доминира у производима реакције.

    Раст траженог производа у геометријској прогресији је ограничен количином реагенса, присуством инхибитора, формирањем нуспроизвода. У последњим циклусима реакције, раст се успорава, што се назива "ефект платоа".

    • РПА (Енгл. Рецомбинасе Полимерасе Амплифицатион - Рекомбиназа полимераза амплификација) - користи се где је потребно појачавање ДНК / РНК 15 минута без термалног циклера (изотермна реакција) [18] [19]
    • Нестед ПЦР (Нестед ПЦР (Енг.)) - користи се за смањење броја нуспродуката реакције. Користе се два пара прајмера и врше се две узастопне реакције. Други пар прајмера амплификује регион ДНК унутар производа прве реакције.
    • Инвертед ПЦР (Инверзни ПЦР (Енг.)) - користи се ако је познат само мали део у оквиру жељене секвенце. Овај метод је посебно користан када је потребно одредити суседне секвенце након инсерције ДНК у геном. За имплементацију инвертованог ПЦР-а извршена је серија резања ДНК са рестриклизама, након чега следи повезивање фрагмената (лигација). Као резултат, познати фрагменти се појављују на оба краја непознатог региона, након чега се може обавити ПЦР као и обично.
    • ПЦР са реверзном транскрипцијом (Реверзна транскрипција ПЦР, РТ-ПЦР (енглески)) - користи се за амплификацију, изолацију или идентификацију познате секвенце из РНК библиотеке. Пре конвенционалне ПЦР, молекула једноланчане ДНК се синтетише на мРНА шаблону користећи ревертазу и добија се једноланчана цДНА, која се користи као шаблон за ПЦР. Овај метод често одређује где и када су ти гени изражени.
    • Асимметриц ПЦР (Енглески Асиметрични ПЦР) - се изводи када је потребно појачати углавном један од ланаца оригиналне ДНК. Користи се у неким анализама секвенцирања и хибридизације. ПЦР се изводи као и обично, осим што се један од примера узима у великом сувишку. Модификације овог метода је енглески.Линеар-Афтер-Тон-Екпонентиал-ПЦР (ЛАТЕ-ПЦР), који користи прајмере са различитим концентрацијама, и прајмер ниске концентрације је изабран са вишом (тачка топљења) од прајмера високе концентрације. ПЦР се изводи на високој температури жарења, тако да је могуће одржавати ефикасност реакције током свих циклуса [20].
    • Квантитативна ПЦР (Квантитативни ПЦР, К-ПЦР (енглески)) или ПЦР у реалном времену - користи се за директно посматрање мерења количине специфичног ПЦР производа у сваком реакционом циклусу. Овај метод користи флуоресцентно обележене прајмере или ДНК пробе да би тачно измерио количину производа реакције док се акумулира или се користи флуоресцентна интеркалацијска боја. Сибр зелена и (али боље користити СИТО 13), који се веже за дволанчану ДНК. Сибр зелена и обезбеђује једноставну и економичну опцију за детектовање и квантификовање ПЦР производа током ПЦР у реалном времену без потребе за специфичним флуоресцентним сондама или прајмерима. Током појачавања боје СИБР Греен И он се убацује у мањи жлеб ДНК ПЦР производа и емитује флуоресцентни сигнал, јачи од невезаног боје, када се озрачује плавим ласером. СИБР Греен И совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный) [21] .
    • Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.) ) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Први циклуси се изводе на температури изнад оптималне температуре жарења, а затим се сваких неколико циклуса температура жарења постепено смањује до оптималне. Ово је учињено како би се осигурало да прајмер хибридизује са комплементарним ланцем дуж целе његове дужине, док на оптималној температури жарења, прајмер делимично хибридизује са комплементарним ланцем. Делимична хибридизација прајмера на геномској ДНК доводи до неспецифичног амплификације, ако постоји доста места везивања за прајмер. У већини случајева, првих десет циклуса ПЦР-а може се извести на температури жарења од 72-75 ° Ц, а затим одмах смањити на оптималну, на пример, на 60-65 ° Ц.
    • Метод молекуларне колоније (ПЦР у гелу, енглеска колонија - ПЦР колонија) - полимеризација акриламидног гела са свим компонентама ПЦР на површини и извршити ПЦР. У тачкама које садрже анализирану ДНК долази до појачавања молекулских колонија.
    • ПЦР са брзом амплификацијом цДНА завршава (рођен Рапид амплификација цДНА крајева, РАЦЕ-ПЦР).
    • ПЦР дугих фрагмената (енг. Лонг-ранге ПЦР) - модификација ПЦР за амплификацију проширених региона ДНК (10 хиљада или више база). Користи мешавину две полимеразе, од којих је једна - Так-полимераза са високом процесном способношћу (која је способна да синтетизује дуги ланац ДНК у једном пролазу), а друга је ДНА полимераза са 3'-5'-егзонуклеазном активношћу, обично полимераза Пфу. Друга полимераза је неопходна да би се исправиле грешке које су прво уведене, јер Так-полимераза зауставља синтезу ДНК ако се дода не-комплементарни нуклеотид. Овај не-комплементарни нуклеотид уклања Пфу полимеразу. Мешавина полимераза је узета у односу 50: 1 или чак мање од 100: 1, где Так-полимераза се узима 25-100 пута више него Пфуполимери.
    • Рапд (Енг. Рандом Амплифицатион оф Полиморпхиц ДНА), ПЦР са насумичном амплификацијом полиморфне ДНК - користи се када је потребно разликовати организме сличне генетичком секвенцом, на примјер, различите сорте култивираних биљака, пасмине паса или блиско сродних микроорганизама. У овој методи се обично користи један мали прајмер (око 10 бп). Овај прајмер ће бити делимично комплементаран насумичним регионима ДНК испитиваних организама. Одабиром услова (дужина примера, састав, температура, итд.), Могуће је постићи задовољавајућу разлику у ПЦР узорку за два организма.
    • ПЦР специфичан за групу (ПЦР специфичан за групу) - ПЦР за сродне секвенце унутар једне или између различитих врста користећи конзервативне прајмере за ове секвенце. На пример, избор универзалних прајмера за рибозомалне гене 18с и 26с за амплификацију секвенце ген-специфичне интергенске спацер: гена 18с и 26с конзервативан међу врстама, стога ће се ПЦР између ових гена изводити за све испитиване врсте. Супротно од ове методе је јединствени ПЦР (енг. унит ПЦР), где је задатак да одабере прајмере за појачавање само једне секвенце свих повезаних.
    • ПЦР помоћу врућег старта (Енглисх Хот-старт ПЦР) - модификација ПЦР-а користећи ДНК полимеразу, у којој је активност полимеразе блокирана на собној температури са антителима или малим молекулима типа Аффибоди који имитирају антитела, то јест, у тренутку постављања реакције пре прве денатурације у ПЦР. Типично, прва денатурација се изводи на 95 ° Ц током 10 минута.
    • Виртуал ПЦР (енг. ин силицо ПЦР, дигитални ПЦР, електронски ПЦР, е-ПЦР) је математички метод компјутерске анализе теоријске ланчане реакције полимеразе користећи листу секвенци примера (или ДНА пробе) за предвиђање потенцијалне амплификације ДНК генома, хромозома, кружне ДНК или било који други комад ДНК.

    Ако је нуклеотидна секвенца шаблона делимично или непозната, можете користити дегенерисани прајмеричија секвенца садржи дегенерисане положаје у којима се могу налазити све базе. На пример, секвенца прајмера може бити: ... АТХ ...где Х је А, Т или Ц.

    ПЦР се користи у многим областима за анализу и научне експерименте.

    Форенсицс Едит

    ПЦР се користи за поређење такозваних "генетских отисака прстију". Потребан је узорак генетског материјала са мјеста злочина - крви, пљувачке, сперме, косе, итд., Који се успоређује с генетским материјалом осумњиченог. Врло мала количина ДНК је довољна, теоретски, једна копија. ДНК се цијепа на фрагменте, затим амплификује помоћу ПЦР. Фрагменти се раздвајају електрофорезом у ДНК. Добија се узорак распореда ДНК трака генетски отисак прста (енг. генетиц фингерпринт).

    Уреди медицинску дијагностику

    ПЦР омогућава значајно убрзавање и олакшавање дијагнозе насљедних и вирусних болести. Жељени ген је амплификован помоћу ПЦР помоћу одговарајућих прајмера, а затим секвенциран да би се одредиле мутације. Вирусне инфекције могу се открити одмах након инфекције, неколико недеља или месеци пре него што се појаве симптоми болести.

    Персонализед медицине Едит

    Понекад су лекови токсични или алергични за неке пацијенте. Разлози за то су дијелом и индивидуалне разлике у осјетљивости и метаболизму лијекова и њихових деривата. Ове разлике се одређују на генетском нивоу. На пример, код једног пацијента одређени цитокром (протеин јетре, одговоран за метаболизам страних супстанци) може бити активнији, у другом - мање. Да би се одредило који тип цитокрома има овај пацијент, предлаже се да се изврши ПЦР анализа пре коришћења лека. [ извор није наведен 3300 дана Таква анализа се назива прелиминарна генотипизација (енгл. Проспецтиве генотипинг).

    Клонирање гена Едит

    Клонирање гена (не треба га мешати са клонирањем организама) је процес изоловања гена и, као резултат манипулације генетског инжењеринга, добијање велике количине производа датог гена. ПЦР се користи за амплификацију гена, који се затим убацује у вектор - фрагмент ДНК који носи ванземаљски ген у истом или другом, погодном за раст, организам. Као вектори, на пример, користе се плазмиди или вирусна ДНК. Уметање гена у страни организам се обично користи за добијање производа овог гена - РНК или, најчешће, протеина. Тако се у индустријским количинама добијају многи протеини за употребу у пољопривреди, медицини итд.

    Секвенцирање ДНК Уреди

    У методи секвенцирања употребом флуоресцентно обележеног или радиоактивног изотопа дидеоксинуклеотида, ПЦР је интегрални део, пошто се током полимеризације нуклеотиди обележени са флуоресцентном или радиоактивном ознаком убацују у ланац ДНК. Додавање дидеоксинуклеотида у синтетизовани ланац доводи до прекида синтезе, што омогућава да се одреди положај специфичних нуклеотида након раздвајања у гелу.

    Loading...